常用的蛋白純化技術介紹
摘要：本文介紹了在蛋白表達純化試驗中，對不同來源的材料的預處理。主要從植物，動物和微生物三種源材料的特點和注意事項進行描述，并附有原核蛋白表達的案例。
蛋白質在分子生物學中的分類，大體上可分為天然蛋白和重組蛋白。提取天然蛋白和構建重組蛋白都需要先確定生物原材料，如植物材料主要以植物的葉，胚，果實和根莖等為主；動物通常是選用實驗動物的器官和組織；而微生物則是微生物菌體本身或發(fā)酵液。從原則上講，任何一種自然界中存在或不存在的蛋白質都可以被外源表達出來，像原核蛋白表達就是以大腸桿菌（E.coli）為宿主菌表達克隆基因，在原核表達體系中，重組蛋白的含量比雜蛋白的含量高的多，所以選擇和設計合適的分離純化方案對于重組蛋白表達純化的下游實驗就顯得尤為重要。
在提取和分離蛋白時有以下幾點需要注意：
蛋白質提取應盡量多的提取出活性蛋白，避免各因素導致目的蛋白失活；
選用不同的溶劑提取分離蛋白質（大多數蛋白溶于水，稀鹽，稀酸等，少數與脂類結合的蛋白則溶于乙醇等有機溶劑）；
提取蛋白一般在低溫環(huán)境中操作，避免蛋白質在提取過程中降解（可加入蛋白酶控制劑，如PMSF、EDTA、antipain 和 leupeptin等）；
提取時緩沖液的用量通常是原材料的1~5倍，提取時注意均勻攪拌，這樣有利于蛋白的溶解（緩沖液通常選用PH≈7,0.15mol/L磷酸鹽緩沖液或PH7.5,0.1mol/L Tris-Hcl緩沖液）；
蛋白質提取常用各種水溶液，一般是在偏離等電點0.5pH以上，此時蛋白的溶解度增加；
用稀酸提取等電點在堿性范圍內的蛋白質，用稀堿提取等電點在酸性范圍內的蛋白，盡可能提高目的蛋白在提取液中的溶解度。
不同材料的處理：
1. 植物材料的預處理
植物體內通常存在著為數眾多的天然蛋白，提取時通常選用一些器官為主要原料。但植物提取蛋白時存在一些特殊問題，導致蛋白質的得率較動物和微生物的要低。
因為植物材料中除目的蛋白外還含有大量的淀粉，纖維素和果膠等雜志，所以初步的均質化處理需要在大量緩沖液中進行，初步過濾后得到低濃度蛋白，之后需要進行硫酸銨沉淀和PEG沉淀進行分離，分離后的蛋白可與其他蛋白一樣，采用一般的蛋白純化處理。
2. 動物材料的預處理
動物原材料組織中含有豐富的目的蛋白，根據蛋白質所處的不同位置（胞內，胞外，亞細胞器等），應選用不同的組織破碎方式。對于少量組織，可使用小型均質器，大量組織則采用搗碎機快速搗碎方法。對于軟組織，可使用玻璃均質器。組織均質化后，將不同亞細胞結構內的蛋白酶釋放到溶液中，使之與目的蛋白接觸并降解，再進行純化處理。
注意：均質化時間盡可能短，減少不必要的蛋白質水解變性
在4℃預冷的緩沖液中進行均質化處理和后期分離操作，有助于降低蛋白質水解
 在緩沖液中添加蛋白酶控制劑控制蛋白質水解
3. 微生物材料的預處理
微生物可產生多種天然蛋白和重組蛋白，提取天然蛋白，首先要對大量菌株篩選獲得高產菌株，再進行誘變育種分離產量更高的正突變菌株，再通過基因工程技術提高內源微生物蛋白產量。而重組蛋白的提取相對來說就簡單地多，微生物可以通過發(fā)酵的方式，短時間內大量培養(yǎng)，從而分離出大量可純化的目的蛋白。與植物和動物處理方法相比較，微生物蛋白通常比來源于植物和動物的相同蛋白質要更加穩(wěn)定，也更易于遺傳學操作。只要篩選出正確的培養(yǎng)條件，就可以獲得大量的特定蛋白質菌體。
4. 細菌的裂解
細胞的破碎裂解是指用物理、化學、酶或機械等方法破壞細胞壁或細胞膜，從而將胞內物質（目的蛋白）釋放到周圍環(huán)境的過程。針對不同用途和類型的細胞壁發(fā)展了多種方法，目前常用方法大體上可分為機械法和非機械法倆類，常用的機械破碎法有：高溫珠磨法；高壓勻漿；超聲破碎法。而非機械法包括滲透壓沖擊法；凍融破碎法；酶溶法；化學破碎法等。下面介紹在實驗室研究中應用較為廣泛的酶溶法和超聲破碎法。
酶溶法
常用的溶解酶有；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。主要作用于細菌類，而其他幾種酶對酵母作用較為顯著。
主要步驟為：
4 ℃，5000rpm 離心15 min，收集誘導表達的細菌培養(yǎng)液（100 mL）。棄上清，每克濕菌內加3 mL
裂解緩沖液，懸浮沉淀；
沉淀稱量，每克菌內加8mL PMSF及80mL，攪拌20 min；邊攪拌邊每克菌加4 mg脫氧膽酸
（低溫中進行）；
37 ℃，玻棒攪拌，至溶液粘稠時每克菌內加20mL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。
超聲破碎法
聲頻為 15-20 kHz 的超聲波在強度聲能輸入下可以對細胞進行破碎，在處理少量樣品時具有操作簡便，重復性好，節(jié)省時間，液體量損失較少等優(yōu)勢，同時還可對染色體DNA進行剪切，降低液體的粘稠度。
主要步驟為：
收集 1 L 誘導表達的工程菌，40 ℃ ，5000

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